Современные методы диагностики предрасположенности к злокачественной гипертермии

злокачественная гипертермияЗлокачественная гипертермия (ЗГ) — фармакогенетическое заболевание с аутосомно-доминантным типом наследования, фенотипически проявляющееся гиперметаболизмом скелетных мышц и рабдомиолизом при воздействии определенных веществ. Считается, что частота кризов ЗГ составляет в среднем 1:50 000 анестезий у взрослых и 1:3000—1:15000 анестезий у детей. Вероятно, истинное число лиц, имеющих предрасположенность к ЗГ (ПЗГ), гораздо выше. Во-первых, у пациентов с ПЗГ в анамнезе могут быть операции под общей анестезией без особенностей. Во-вторых, не каждый пациент с ПЗГ пройдет через общую анестезию.

 

В большинстве случаев причиной ПЗГ является унаследованная мутация гена, кодирующего рианодиновый рецептор первого типа RyR1 — кальциевый канал саркоплазматического ретикулума (СР) поперечно-полосатых мышц. Нарушение структуры рецептора приводит к тому, что сукцинилхолин и все ингаляционные анестетики (так называемые препараты-триггеры), кроме закиси азота и ксенона, прочно связываются с ним, переводя канал в перманентно открытое состояние.

 

Концентрация Са2+ в саркоплазме начинает стремительно нарастать, несмотря на сохранность механизма его обратного захвата, что вызывает более или менее генерализованное неразрешающееся сокращение скелетных мышц по типу контрактуры. Мышечное сокращение — весьма энергоемкий процесс, но при развитии контрактуры из- за того, что перемещение равно нулю, энергия переходит не в форму механической работы, а в форму тепла. Это и является причиной подъема температуры, наблюдающегося при кризе ЗГ примерно у трети пациентов.

 

Рост потребления О2 и массивное образование СО2 в результате мышечного сокращения формируют системный гиперметаболизм и гипоксию, непрерывное мышечное сокращение становится причиной »механической’ ишемии скелетной мышечной ткани, быстро исчерпывается кислородная емкость миоглобина, являющегося аккумулятором О2 для сокращенных мышц. В итоге развивается рабдомиолиз — разрушение поперечно-полосатых мышц. В дальнейшем грубые системные метаболические расстройства быстро приводят к полиорганной недостаточности.

 

Диагностика ПЗГ осуществляется двумя способами: при помощи галотан-кофеинового контрактурного теста (ГККТ) in vitro (в Европе его обычно называют in vitro contracture test — IVCT, а в США — Caffeine-halothane contracture test — CHCT) или при помощи методов генетического исследования. Несмотря на расширяющиеся возможности генетического анализа, ГККТ до сих пор остается «золотым стандартом» диагностики ПЗГ.

 

Последовательность применения диагностических методов может быть разной. В некоторых странах ГККТ предпочитают проводить сразу и у кровных родственников пациента с ПЗГ, оставляя генетическое обследование дополнительной опцией, поскольку отрицательный результат генетического исследования не означает, что пациент не предрасположен к ЗГ.

 

В России проблема ЗГ в настоящее время остается нерешенной. Во-первых, в условиях большинства отечественных стационаров затруднительна даже ранняя диагностика криза ЗГ: капнографами, позволяющими максимально быстро диагностировать криз, зачастую не оснащены даже крупные клиники больших городов. Во- вторых, на сегодняшний день в России имеется единственный консультативный центр по проблеме ЗГ, где есть возможность проведения генетического исследования, но нет ни одной лаборатории для выполнения ГККТ.

 

В 2012 г. Федерацией анестезиологов и реаниматологов России был создан Комитет по проблеме ЗГ, отвечающий, в частности, за создание и развитие сети консультативно-диагностических центров в нашей стране. Грант Всемирной федерации обществ анестезиологов (WFSA) позволил подготовить специалиста по проведению ГККТ для России, переняв опыт европейских коллег. На данный момент кафедрой анестезиологии и реаниматологии им. В.Л. Ваневского Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова в Санкт-Петербурге проводятся работы по оснащению такой лаборатории на базе Клинического госпиталя МСЧ МВД России по Санкт-Петербургу и Ленинградской области.

 

Галотан-кофеиновый тест

 

ГККТ является лабораторной моделью реакции скелетных мышц на воздействие препаратов-триггеров ЗГ, основанной на использовании биопсийного материала.

 

Для биопсии чаще всего используют mm. quadriceps femoris, vastus medialis, vastus lateralis и biceps brachii. Операцию проводят открытым способом, по возможности в условиях регионарной анестезии. Биопсия должна выполняться строго при отсутствии рефлекторной чувствительности мышечных волокон. Крайне важна техника взятия биоптата: следует избегать натяжения мышцы и не использовать электрокоагуляцию до момента полного иссечения мышечного фрагмента.

 

По протоколу Европейской группы по злокачественной гипертермии (EMHG), после забора биоптат мышцы немедленно помещают в емкость с преоксигенированным (можно использовать линию подачи увлажненного О2 непосредственно от наркозного аппарата) или прекарбоксигенированным (используется 5% карбоген) раствором Рингера или Кребса—Рингера комнатной температуры, а затем в течение максимум 15 мин доставляют его в диагностическую лабораторию. Жизнеспособность биоптатов мышечной ткани зависит от условий, в которых они находятся в лаборатории, и варьирует в пределах от 5 до 24 ч. Наиболее сохранны цельные биоптаты, помещенные в карбоксигенируемый раствор Кребса—Рингера комнатной (23—25°С) температуры с pH 7,4.

 

Для теста готовят пучки мышечных волокон пациента толщиной 2—3 мм и массой 100—200 мг, которые лигируют ниткой с обеих сторон для фиксации. Длина образца между фиксирующими лигатурами должна быть 15—25 мм. Фрагмент мышцы помещают в ванночку для изолированных органов объемом 5—10 мл, перфузируемую подогреваемым до 37°С раствором Кребса—Рингера. Верхняя фиксирующая лигатура оканчивается петлей, которая прикрепляется к датчик мышечного усилия (изометрическому трансдьюсеру).

 

Мышечный фрагмент растягивают до достижения усилия 2 г; необходимо дождаться стабилизации мышцы, т.е. момента, когда колебания изолинии не будут превышать 0,2 г. После проверки качества образца (достижение сокращений > 2 г) можно начинать тест. Для этого в ванночку добавляют препарат-триггер в различных концентрациях и измеряют силу мышечного сокращения, развивающегося при прямой электрической стимуляции мышцы. Рекомендуется выбирать частоту стимуляции 0,1—0,2 Гц, продолжительность импульса от 1 до 10 мс и напряжение от 20 до 100 В.

 

В классическом варианте ГККТ используют кофеин и галотан, однако описаны методики с применением рианодина и 9,21-дегидрорианодина, 4-хлор-метакрезола и севофлурана. В экспериментах на свиньях были предложены протоколы контрактурных тестов с теофиллином и 4-хлор-З-этилфенолом; последний был не информативен в эксперименте на образцах мышечной ткани человека.

 

Есть предположение, что 4-хлор-метакрезол может позволить поставить окончательный диагноз пациентам, у которых результат ГККТ был качественно или количественно неопределенным. В то же время есть данные о том, что применение дополнительных препаратов для ГККТ не повышает ни чувствительности, ни специфичности метода. Были попытки модифицировать протокол ГККТ, заменив галотан на более распространенные современные ингаляционные анестетики — се- вофлуран, энфлуран, изофлуран и десфлуран. Однако именно галотан пока остается самым сильным провокатором ЗГ в эксперименте.

 

Кофеиновый тест

 

Концентрацию кофеина в растворе последовательно повышают до 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0; и 32 ммоль/ л (по химически чистому свободному основанию). Каждое последующее повышение концентрации проводится либо после достижения максимального контрактурного плато на предыдущем этапе, либо после экспозиции мышцы в растворе в течение 3 мин, если контрактура не возникла. Кофеин может добавляться в ванночку как инъекционным болюсом, так и низкообъемной инфузией в раствор. Смену концентрации кофеина следует производить быстро, без промывки биоптата свежим раствором Кребса—Рингера.

 

Результат этого теста фиксируется как пороговая концентрация, т.е. наименьшая концентрация кофеина, вызывавшая достоверное (по меньшей мере на 2 мН — 0,2 г) стойкое увеличение мышечной силы по сравнению с минимальной силой.

 

Качество мышечного фрагмента можно оценить при концентрации кофеина 32 ммоль/л; развитие контрактуры > 5 г свидетельствует о хорошем качестве образца.

 

Галотановый тест

 

Различают статические и динамические варианты галотанового теста. Статические тесты могут быть выполнены как по протоколу Европейской группы ЗГ (EMHG), так и по протоколу Американской ассоциации ЗГ (Malignant Hyperthermia Association of the United States — MHAUS). Динамические тесты более трудоемки и используют их редко.

 

Европейский статический галотановый тест

Галотановый порог определяют при концентрациях 0,11,0,22,0,44 и 0,66 ммоль/л, что эквивалентно 0,5,1,0, 2,0 и 3,0 об. % галотана соответственно. Концентрацию галотана в газовой смеси измеряют максимально близко к входному порту ванночки. Для обеспечения заданной концентрации галотана газоток должен быть не менее 2 л/мин.

Образец мышечной ткани последовательно экспонируют в растворе в течение 3 мин при каждой концентрации. Вычисление галотанового порога такое же, как и при выполнении кофеинового теста. Отмечают максимальное сократительное усилие при концентрации галотана 0,44 ммоль/л (т.е. 2 об. %).

 

Американский статический галотановый тест

Этот вариант галотанового теста более прост в выполнении. После стабилизации мышцы в ванночку подают 3 об. % галотана, экспозицию осуществляют в течение 10 мин. Если возникает контрактура > 5 г, то тест признается положительным.

 

Диагностические критерии оценки результатов ГККТ

 

  • Предрасположенный к ЗГ (ПЗГ): кофеиновый порог находится в диапазоне концентраций кофеина < 2,0 ммоль/л, а галотановый — в диапазоне < 0,44 ммоль/л.
  • Не предрасположенный к ЗГ (НЗГ): кофеиновый порог находится в диапазоне концентраций выше 3,0 ммоль/л, галотановый — выше 0,44 ммоль/л.
  • Вероятно, предрасположенный к ЗГ (ВПЗГ): все прочие результаты считаются сомнительными, но обозначаются как «вероятно, ПЗГ»: ВПЗГг, когда положительным был только галотановый тест, или ВПЗГк, когда положительным был только кофеиновый тест. Все пациенты с ВПЗГ тактически проводятся как ПЗГ.

 

Наибольшая чувствительность ГККТ (97% при 95% ДИ 84—100%) была достигнута при 2-компонентном тесте с диагностическими порогами контрактуры > 0,5 г для 3% галотана и/или > 0,3 г для кофеина в концентрации 2 ммоль/л. Специфичность такого теста равна 78% (95% ДИ 69—85%). Если за критерий диагноза ПЗГ принимать положительные результаты, полученные хотя бы в одном из тестов (галотановом или кофеиновом), то чувствительность ГККТ достигает 99% (95% ДИ 94,8—100%), а специфичность — 93,6% (95% ДИ 89,2—96,5%).

 

Чувствительность и специфичность рианодинового теста равны 84,6 и 90,4% соответственно. Тест с севофлураном считается еще менее чувствительным. Близкие к пороговым значениям показатели (например, < 5 мН (0,5 г) в протоколе EMHG) маловоспроизводимы и, строго говоря, являются ненадежными, однако и такие результаты в целях безопасности пациента также должны трактоваться как положительные.

 

Различие пороговых концентраций в ГККТ у разных пациентов с ПЗГ и ВПЗГ является, по всей видимости, следствием того, что чувствительность RyR1 к триггерным препаратам зависит от варианта и локализации генетического дефекта.

 

Методы генетического анализа

 

Генетика синдрома ЗГ достаточно разнообразна. ПЗГ наследуется по аутосомно-доминантному типу с вариабельной экспрессивностью и неполной пенетрантностью. Семейная генетическая диагностика ПЗГ ограничена достоверностью только положительных результатов и только у тех, кто является носителем доказанных (проверенных в физиологических исследованиях) мутаций.

 

На сегодняшний день известно более 300 мутаций гена RyR1, ассоциированных с ПЗГ, но лишь 31 из них по результатам функциональных исследований была внесена EMHG в список причинных для ПЗГ, а Северо-Американская группа злокачественной гипертермии (NAMHG) формально признала причинными только 29. Это означает, что лишь эти мутации могут быть использованы для скрининга ПЗГ. Молекулярно-генетический анализ показал, что мутации в RyRl определяются у 70—80% людей с доказанной ПЗГ.

 

В качестве методов генетического анализа чаще всего используются секвенирование и мультиплексная амплификация лигазно связанных проб (multiplex ligation dependent probe amplification — MLPA). Дешевизна, точность, а также сравнительная простота автоматизации секвенирования делает этот метод своеобразным эталоном среди всех существующих способов определения последовательности ДНК. MLPA позволяет амплифицировать несколько участков ДНК с помощью одной пары праймеров, что делает метод менее трудоемким, но в то же время и менее чувствительным: наборы для MLPA позволяют проанализировать строго определенное количество небольших фрагментов ДНК. В последнее время применяется и высокоточный анализ кривых плавления (High Resolution Melting — HRM) — чувствительный и экономически эффективный инструмент для определения вариантов последовательности нуклеотидов в сложных генах.

 

Выявление мутаций у пациентов с результатами ГККТ, расцененными как ВПЗГ, может верифицировать диагноз ПЗГ. Отрицательный результат ГККТ при наличии доказанной мутации гена RyR1 позволяет предположить, что пенетрантность может варьировать вследствие пока еще неизвестных факторов.

 

В семьях с известными ЗГ-мутациями вероятность подтвердить ПЗГ равна 50%. Прогностическая ценность отрицательного результата генетического анализа равняется 0,95 (95% ДИ 0,75—0,99), но для безопасности пациента, в соответствии с рекомендациями EMHG, следует выполнить ГККТ. Поскольку отрицательный результат молекулярно-генетического анализа не исключает ПЗГ, в настоящее время он не может считаться эквивалентной заменой ГККТ.

 

Основным преимуществом генетического анализа, если мутация была найдена, является возможность обследовать всех кровных родственников с минимальными затратами (проводится исследование только на одну данную мутацию).

 

Гистологическое исследование

 

В некоторых центрах часть биоптата отправляют на гистологическое и биохимическое исследование. Морфологический анализ мышечной ткани помогает уточнить патофизиологию ЗГ, но не является рутинной методикой выявления ПЗГ.

 

Заключение

 

Таким образом, создание в России всего спектра современных возможностей для диагностики ПЗГ предполагает воспроизведение технологий ГККТ и генетического исследования, описанных в настоящем обзоре. Пока в нашей стране освоена только вторая из них, которую может выполнять консультативный центр по проблеме ЗГ, работающий при кафедре анестезиологии и реаниматологии им. В.Л. Ваневского Северо-западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург). Авторы надеются, что в 2014 г. у них появится возможность впервые в России выполнить и ГККТ.

 

Казанцева А.А., Лебединский К.М.

2014 г.

 
Опубликовано в рубрике Вопросы анестезиологии